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什么是自發(fā)熒光？自發(fā)熒光 (Autofluorescence, AF) 是指細(xì)胞內(nèi)因存在的某些熒光成分和代謝產(chǎn)物在受到特定波長光激發(fā)時(shí)產(chǎn)生的固有熒光。常見的內(nèi)源性熒光物質(zhì)，如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 、氧化型黃素輔酶 (FMN/FAD) 、維生素以及含有芳香族氨基酸（如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）的蛋白質(zhì)。

自發(fā)熒光（AF）干擾給流式細(xì)胞術(shù)的檢測帶來巨大的困擾，使熒光信號(hào)的檢測、定量和解釋更加復(fù)雜。同時(shí)，異質(zhì)性的自發(fā)熒光在不同細(xì)胞類型和成分之間變化，使結(jié)果分析復(fù)雜性增加。

流式細(xì)胞術(shù)中AF的挑戰(zhàn)

雖然AF有助于評(píng)估細(xì)胞狀態(tài)，但其光譜干擾（尤其在400-600 nm區(qū)間）會(huì)掩蓋弱信號(hào)標(biāo)記物（如FITC/Alexa Fluor 488），導(dǎo)致：

• 信號(hào)分辨率下降：巨噬細(xì)胞、死細(xì)胞等高AF細(xì)胞影響顯著；

• 動(dòng)態(tài)波動(dòng)干擾：細(xì)胞大小、代謝狀態(tài)、固定方法均會(huì)改變AF強(qiáng)度；

• 影響細(xì)胞類型結(jié)果特異性：髓系細(xì)胞（富含熒光顆粒）、抗原呈遞細(xì)胞（高線粒體含量）AF本底高。

圖1：細(xì)胞自發(fā)熒光差異示例

A. 植物細(xì)胞流式分析：由于不同細(xì)胞成分和色素導(dǎo)致的各個(gè)通道的AF差異，特別是葉綠素導(dǎo)致特定通道高AF（數(shù)據(jù)來源：都柏林大學(xué)學(xué)院（UCD）流式細(xì)胞技術(shù)核心主任Alfonso Blanco博士分享）

如圖1所示，在未染色的植物提取物中檢測到升高的自發(fā)熒光（AF）水平，提示后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析可能存在潛在的復(fù)雜性。實(shí)驗(yàn)程序和染色技術(shù)，如醛固定和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，也會(huì)影響細(xì)胞的自發(fā)熒光水平，從而增加細(xì)胞分析中自發(fā)熒光的復(fù)雜性和變異性。

傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)無法有效區(qū)分AF，業(yè)內(nèi)的研究都把希望寄托在光譜流式細(xì)胞術(shù)，但此前的光譜流式細(xì)胞術(shù)也面臨諸多難題。

光譜流式細(xì)胞術(shù)中的AF難題

光譜流式細(xì)胞術(shù)通過捕捉每種熒光分子在廣泛波長范圍內(nèi)的整個(gè)發(fā)射光譜，為其生成唯一的光譜特征，隨后用于特定光譜解混和識(shí)別。然而，光譜流式通過全光譜捕獲實(shí)現(xiàn)多色解混，但AF仍帶來三大挑戰(zhàn)（圖2）：

• 異質(zhì)性AF干擾：不同細(xì)胞類型的AF光譜特征各異；

• 弱信號(hào)掩蔽：高AF背景淹沒低表達(dá)靶標(biāo)信號(hào)；

• 光譜重疊：AF與熒光標(biāo)記發(fā)射譜重疊導(dǎo)致假陽性。

圖2：AF在光譜流式中的典型干擾

A. 不同細(xì)胞的異質(zhì)性AF信號(hào)；B. 高AF導(dǎo)致弱信號(hào)群體難識(shí)別；C. AF與目標(biāo)熒光光譜重疊

如何應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)和難題，需要全面了解樣本、精心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、嚴(yán)格的去混合技術(shù)以及適當(dāng)?shù)膶?duì)照，以提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)，使用多個(gè)通道區(qū)分自發(fā)熒光信號(hào)和特定的熒光染料至關(guān)重要，因此我們需要一臺(tái)功能更全面的科研利器的助力。

貝克曼庫爾特生命科學(xué)近期上市的??CytoFLEX mosaic光譜流式分析儀可提供10個(gè)未染色通道，可從中提取不同群體的自發(fā)熒光特征，提升弱信號(hào)的檢測能力，幫助發(fā)現(xiàn)低豐度亞群。

下圖顯示了在CytoFLEX mosaic光譜流式分析儀上評(píng)估了AF提取對(duì)白細(xì)胞群體譜解混的影響，并評(píng)估了使用多個(gè)AF特征是否進(jìn)一步改善了解混。

針對(duì)不同細(xì)胞群體（中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）表面標(biāo)志物表達(dá)的直方圖，在同一文件中考慮了0、1、2或4個(gè)自發(fā)熒光簽名在解混矩陣中的影響。紅色（No AF）表示沒有進(jìn)行自發(fā)熒光提取的數(shù)據(jù)，藍(lán)色（1 AF）表示去除一個(gè)自發(fā)熒光簽名后的數(shù)據(jù)，橙色（2 AF）表示去除兩個(gè)自發(fā)熒光簽名后的數(shù)據(jù)，綠色（4 AF）表示去除四個(gè)自發(fā)熒光簽名后的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，通過優(yōu)化AF校正，減少了嗜酸細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中假陽性CD16的情況，同時(shí)保留了真實(shí)的生物信號(hào)。

超越噪音：光譜流式細(xì)胞術(shù)

中自發(fā)熒光管理的策略

光譜流式方案

1對(duì)于簡單樣本：未染色的自發(fā)熒光細(xì)胞有獨(dú)特光譜指紋，可將其作內(nèi)源性染料，設(shè)計(jì)檢測方案，計(jì)算去除自發(fā)熒光，能準(zhǔn)確分析特定標(biāo)記熒光，對(duì)識(shí)別低豐度標(biāo)記、描繪其表達(dá)和亞群分布及提高陽性群體分辨率關(guān)鍵。

2對(duì)于異質(zhì)性AF樣本：建立多類型AF光譜數(shù)據(jù)庫；采用多元未染色對(duì)照捕獲AF變異，建議使用多樣的未染色對(duì)照，能夠有效地考慮不同細(xì)胞類型所展現(xiàn)的自發(fā)熒光強(qiáng)度的固有變異性。??CytoFLEX mosaic光譜流式分析儀可提供多達(dá)10個(gè)未染色通道，可幫助異質(zhì)性樣本建立更多元的光譜模型。

3靶標(biāo)結(jié)合光譜變異：對(duì)像串聯(lián)聚合物染料這樣的熒光素，通過基于微球或細(xì)胞對(duì)照驗(yàn)證實(shí)現(xiàn)最佳解析結(jié)果，排除自發(fā)熒光信號(hào)影響。

4通過門控分群、降維聚類等方法提升AF解析精度：先進(jìn)的光譜去混合算法和適當(dāng)?shù)难a(bǔ)償對(duì)照可以更好地將真實(shí)信號(hào)與噪聲隔離，從而顯著提高流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的精度和可靠性。CytoFLEX mosaic??提供泊松混合 (Poisson hybrid) 算法，憑借更符合實(shí)際的統(tǒng)計(jì)模型、更精準(zhǔn)的信號(hào)控制能力，以及更高的抗干擾能力，能夠有效地提高光譜流式細(xì)胞術(shù)的分析精度和數(shù)據(jù)質(zhì)量。

CytoFLEX mosaic還提供了光譜拆分后的結(jié)果驗(yàn)證功能，實(shí)時(shí)評(píng)估解析準(zhǔn)確性。當(dāng)數(shù)據(jù)出現(xiàn)異常時(shí)，儀器能自動(dòng)提示潛在問題通道，讓研究人員輕松快速地排除數(shù)據(jù)隱患，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。最后，光譜分析軟件CytExpert for Spectral，延續(xù)了CytExpert軟件智能易操作的特點(diǎn)，非常容易學(xué)習(xí)和操作。