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貝克曼庫爾特 | 高通量篩選大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)用酵母營養(yǎng)素

貝克曼庫爾特 | 高通量篩選大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)用酵母營養(yǎng)素
貝克曼庫爾特生命科學  2022-06-14  |  閱讀:2077

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隨著重組DNA技術(shù)的迅猛發(fā)展,外源基因在不同宿主中的表達使得各種重組蛋白的工業(yè)生物生產(chǎn)成為可能。選擇合適的宿主是生物工藝設(shè)計中的關(guān)鍵步驟之一,具體取決于:

1.上游培養(yǎng)效率

2.易于基因編輯和分子工具的可用性

3.翻譯后修飾的能力,如糖基化

4.蛋白質(zhì)(用于下游加工和作為生物制藥成分等)的分泌能力

目前,多種生物已被應(yīng)用于重組蛋白的生產(chǎn),尤其是大腸桿菌,易于基因改造,具有在酵母水解物等多種基質(zhì)上快速生長并產(chǎn)生高蛋白滴度的優(yōu)勢。已成為迄今為止業(yè)界追捧的主力軍。

典型的生物工藝優(yōu)化通常需要進行一些初步試驗,以發(fā)現(xiàn)適用于宿主菌株并提高目的重組蛋白表達的培養(yǎng)基成分(特別是氮基營養(yǎng)素)。對于此類應(yīng)用需求,能夠提高實驗效率和參數(shù)準確度的高通量篩選平臺成為熱門工具。貝克曼庫爾特BioLector通過在線測量關(guān)鍵培養(yǎng)參數(shù)提供可放大的高通量分析。

本案例為通過BioLector對多種酵母營養(yǎng)素就生物量生長和重組蛋白的形成進行評估和比較,篩選出了適合大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)和誘導(dǎo)時間的理想培養(yǎng)基。


方法


培養(yǎng)菌株:大腸桿菌BL21(DE3)pET-28a(+)EcFbFP。

培養(yǎng)基:以標準TB培養(yǎng)基(Carl Roth)為參照物,對多個TB 樣(Terrific 液)培養(yǎng)基進行比較。不同的TB 樣培養(yǎng)基使用不同的酵母提取物。

BioLector培養(yǎng)條件:在接種至微孔板之前,先在250 mL搖瓶中進行預(yù)培養(yǎng), 37°C培養(yǎng)6小時。然后使用48孔梅花板(MTP-BOH2)在 BioLector中進行培養(yǎng)。溫度 37°C ,振搖速度:1400 rpm。分別在每個培養(yǎng)孔中填充800μL培養(yǎng)液用于非誘導(dǎo)實驗,填充790μL用于誘導(dǎo)實驗。誘導(dǎo)實驗中,在誘導(dǎo)時間點上添加 10μL 50μM 的 IPTG。環(huán)境氧氣濃度保持在35%,避免培養(yǎng)物缺氧。

BioLector在線測量:培養(yǎng)過程中對生物量、EcFbFP(黃素熒光蛋白)、pH以及 DO進行在線測量。


結(jié)果

不同TB樣培養(yǎng)基的生物量生長情況:

3.1.png


培養(yǎng)實驗中,不同酵母營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中生物量的生長情況如上圖所示:培養(yǎng)基不同,最終的光密度和生長速率也會不同。ProCel 6 中的大腸桿菌OD最高,培養(yǎng)基 ProCel 3 中的大腸桿菌的OD低。ProCel 6為本特定工藝的最高生長速率。

3.2.png


上圖為培養(yǎng)過程的DO值。培養(yǎng)基 ProCel 3 和 ProCel 4 中的培養(yǎng)物未達到0%的氧飽和度,這表明由于耗氧量有限,該培養(yǎng)基中的菌株代謝活性較低。相反,其他培養(yǎng)物包括TB標準培養(yǎng)基,均在短時間內(nèi)達到0%的氧飽和度,表明菌株代謝活性高。


不同酵母營養(yǎng)素TB樣培養(yǎng)基的產(chǎn)物生成:


通過將IPTG 添加到培養(yǎng)物中來誘導(dǎo) T7 聚合酶的表達促進黃素熒光蛋白的生成。BioLector使用梅花板為48個培養(yǎng)物提供了獨立的培養(yǎng)空間,因此可測試不同的誘導(dǎo)時間點。使用自動化工作站整合BioLector后的 RoboLector 系統(tǒng)還可以自動進行培養(yǎng)誘導(dǎo)。

首先選擇一個固定的誘導(dǎo)時間點。分別為培養(yǎng)啟動后的3小時、3.75小時和4.5小時。下圖所示為每種TB樣培養(yǎng)基在誘導(dǎo)時間下所測熒光的平均值。熒光動力學清晰地表明不同培養(yǎng)基有不同的EcFbFP(黃素熒光蛋白)表達水平。

表現(xiàn)出最強熒光信號的兩個樣本為:ProCel 2,誘導(dǎo)點為3.75小時;ProCel 5,誘導(dǎo)點為 3 小時。經(jīng)過 7.7 小時的培養(yǎng),ProCel 5 的熒光值達到102.94a.u.,而ProCel 2 的熒光值達到 101.82 a.u.。本方法的不足之處在于未比較不同樣本的生物量對蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響。經(jīng)過3小時的培養(yǎng),一些培養(yǎng)物的OD已達到6,而其他培養(yǎng)物僅達到3。當誘導(dǎo)具有不同光密度的培養(yǎng)物時,可能會對在每種酵母營養(yǎng)素上生長的實驗大腸桿菌的蛋白質(zhì)生產(chǎn)性能造成誤解。


3.3.png


鑒于此,我們采用了一種新方法,將誘導(dǎo)點與生物量信號耦合。使用BioLector的信號驅(qū)動RoboLector,依賴于特定生物量的誘導(dǎo)對于每個單獨的孔都是可行的。為自動化工作站設(shè)置3、6或8的OD目標值,以根據(jù)孔內(nèi)培養(yǎng)物的生長動力學自動添加IPTG以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

如下圖所示,ProCel 2表現(xiàn)最佳,最終值為 146.23 a.u.,培養(yǎng)時間是 12.3 小時;ProCel 5表現(xiàn)次之,最終值為138.1 a.u.。與之前進行的一系列實驗相比,本實驗中的排名與在特定時間點進行誘導(dǎo)的實驗不同。這一觀察證明了最佳工藝條件的重要性,并使這些條件具有可比性。此處數(shù)據(jù)表明:與之前的實驗相比,本實驗中的熒光值更高。正如該領(lǐng)域諸多論文中所強調(diào)的那樣,誘導(dǎo)時間確實是一個關(guān)鍵參數(shù)。同樣,在優(yōu)化大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)的過程中,也必須評估誘導(dǎo)劑的濃度。另外,與對照TB培養(yǎng)基相比,這里測試的一些酵母氮源產(chǎn)生了更高的重組蛋白產(chǎn)量。這些結(jié)果凸顯了選擇培養(yǎng)基成分的重要性,這些成分能夠在特定的生物工藝中實現(xiàn)高而穩(wěn)定的產(chǎn)量。


3.4.png


結(jié)論


通過BioLector系統(tǒng),貝克曼庫爾特可為用戶提供適用于各種應(yīng)用領(lǐng)域的高通量篩選平臺。其獨特的梅花形微孔板尤其適用于好氧培養(yǎng),如同實驗室生物反應(yīng)器,BioLector系統(tǒng)通過非侵入式傳感器使客戶能夠獲取更多的在線測量參數(shù)。正如本應(yīng)用,通過BioLector系統(tǒng)可輕松實現(xiàn)培養(yǎng)基的篩選,整合自動化工作站的RoboLector,還可實現(xiàn)更多功能。補料、pH調(diào)控以及文中所述的誘導(dǎo)功能,所有這些均可在小規(guī)模實驗中實現(xiàn),幫助客戶同時兼顧成本和效率。



3.5.png


RoboLector高通量自動化微型生物培養(yǎng)平臺


欲了解該應(yīng)用詳情,請掃描下方二維碼下載應(yīng)用指南《利用BioLector進行大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)用酵母營養(yǎng)素的篩選》


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