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708蛋白聚集

708蛋白聚集
上海奧法美嘉生物科技有限公司  2021-04-12  |  閱讀:1844

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AN-708蛋白聚集

概述

基于治療的蛋白質(zhì)溶液聚集可能產(chǎn)生有害的免疫原性。對于較大尺寸的團(tuán)聚體,可以測量這些團(tuán)聚體,但在0.15至2微米范圍內(nèi)的較小團(tuán)聚體很難量化。動態(tài)光散射(DLS)技術(shù)可以證明聚集體的存在,但不能提供任何關(guān)于聚集體的絕對濃度的信息。單粒光寫傳感器技術(shù)(SPOS)現(xiàn)在可以測量聚集蛋白的大小和濃度,并成為這一應(yīng)用的首選技術(shù)。

引言

生物治療藥物已被證明容易誘導(dǎo)產(chǎn)生抗藥物抗體(ADA)。證據(jù)表明,蛋白質(zhì)聚集具有增強(qiáng)免疫原性的能力,因此增強(qiáng)了對蛋白質(zhì)單體形式的免疫反應(yīng)生物治療蛋白的制造商通常通過一系列步驟準(zhǔn)備注射用藥物,例如:

1.蛋白質(zhì)合成與純化

2.在運(yùn)輸過程中為了穩(wěn)定而進(jìn)行凍干

3.注射前的復(fù)溶

雖然凍干的好處是可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)以供運(yùn)輸,但目前還不清楚凍干蛋白質(zhì)在復(fù)溶后是否會恢復(fù)到其單體狀態(tài)。如果少量的蛋白質(zhì)在這一過程中聚集,就有可能引起患者對治療過程的免疫反應(yīng)。

開發(fā)一種簡單的方法來測定復(fù)溶后大小與濃度的直方圖形式的聚集程度,將能夠在配制過程中篩選這些藥物,以確保在復(fù)溶后中導(dǎo)致單體釋放而不會產(chǎn)生大量的聚合。

 

粒子計數(shù)技術(shù)

很少有技術(shù)能夠測量目標(biāo)尺寸范圍內(nèi)的顆粒大小和濃度以量化蛋白質(zhì)聚集。許多藥學(xué)科學(xué)家都熟悉的光阻法,因?yàn)樗挥糜诿绹鳸SP788-注射液中的不溶性微粒和USP729測量脂質(zhì)乳狀液尾部的試驗(yàn)。但是傳統(tǒng)光阻法的傳感器檢測下限是1μm附近,并且濃度限制對于許多蛋白質(zhì)聚集樣品來說太低。

 

PSS Accusizer FX-Nano系統(tǒng)(如下所示)是設(shè)計在更小的顆粒尺寸和更高的濃度下工作。這是通過使用兩個傳感器完成的;FX-Nano傳感器測量范圍為0.15-0.6μm, LE400傳感器測量范圍為0.5-400μm。新的FX-Nano傳感器使用聚焦光束來減少檢測的總體積,從而提高了傳感器的濃度限制。該傳感器與SIS進(jìn)樣器聯(lián)用,使進(jìn)樣體積低至250μL。此配置通過了USP787治療性蛋白注射劑中的不溶性微粒。

通過兩個傳感器一次就能測試聚合蛋白的大小和濃度,它的動態(tài)范圍是0.15 -40μm 。LE傳感器單獨(dú)使用時的工作范圍為0.5 -400 μm,這使它成為非常靈活的系統(tǒng)。

 

案例1:過濾前后的免疫球蛋白

免疫球蛋白(IgG),約150 kDa, 1% PBS。使用FX和LE傳感器以及SIS采樣器的Accusizer FX- nano來測量未稀釋的樣品。結(jié)果如圖1所示。總顆粒計數(shù)= 109,343,濃度= 9.7 x 108顆/mL。

圖1:未過濾的IgG

 

使用PSS的Nicomp 380動態(tài)光散射儀測試它,通過圖2,以評估單體的大小并大致了解聚集蛋白的大小。峰#1(天然蛋白):14.6nm,強(qiáng)度52%(總質(zhì)量99.6%)。2號峰(聚集的尾巴):395nm,強(qiáng)度為48%(總質(zhì)量的0.4%)。 AccuSizer FX-Nano被用于詳細(xì)研究聚集體在200-500 nm或更大尾端。

圖2: DLS Nicomp380測試未過濾IgG的數(shù)據(jù)

 

蛋白質(zhì)樣品然后通過0.2μm再次過濾后,使用AccuSizer FX-Nano系統(tǒng)分析。過濾前后的對比結(jié)果如圖3所示。PBS的結(jié)果也顯示為黑色。過濾后的濃度從9.7×108顆/mL降低到3.1×108顆/mL。AccuSizer FX-Nano系統(tǒng)可以清楚地看到聚集顆粒尾巴的減少,并且可以輕松識別。

圖3:過濾前(藍(lán)色)和過濾后(紅色)。

 

案例2:孵放前后的免疫球蛋白

樣品制備用于研究孵育對IgG蛋白樣品的影響。圖4顯示了在37°C孵育之前,然后在孵育1和6小時后IgG樣品的粒徑分布。僅使用AccuSizer FX系統(tǒng)測量樣品。將聚集蛋白定義為> 0.7μm,濃度降低如下:9.77、7.75,降至5.08 x 105顆/ mL。顯然,這種聚集程度隨熱培養(yǎng)的增加而降低,表明溶出度提高。聚集體的尾部在圖5中進(jìn)行了放大,以獲得更多詳細(xì)信息。

圖4:時間0(藍(lán)色),1小時(紅色),6小時(黑色)

 

圖5:聚集蛋白尾部的放大

 

案例2:蛋白質(zhì)在不同的儲存和加工條件

客戶提供了未知的蛋白質(zhì)。在AccuSizer FX-Nano上分析了緩沖液和三種不同的制備/存儲條件,以確定顆粒大小和聚集蛋白的濃度。表1中顯示了緩沖液和蛋白質(zhì)樣品中> 0.19 μm的顆粒濃度。圖6中的差異計數(shù)格式和圖7中的累積格式顯示了圖形結(jié)果。

表1:緩沖液和三個蛋白樣品的顆粒濃度

 

圖6:差異分布

 

圖7:累積分布

 

圖8和圖9顯示了相同的聚合蛋白數(shù)據(jù),但Y軸上的濃度以對數(shù)標(biāo)度表示,以便更好地顯示結(jié)果的大濃度范圍。

圖8:微分分布,對數(shù)尺度

 

圖9:積分分布,對數(shù)尺度

 

結(jié)論

AccuSizer FX-Nano提供了一種分析工具,能夠輕松量化蛋白質(zhì)聚集體的大小和濃度。獨(dú)特的兩個傳感器方法涵蓋了動態(tài)范圍的廣泛動態(tài)范圍,可提供聚集蛋白尾巴的詳細(xì)高分辨率視圖。精確的計數(shù)/ mL數(shù)據(jù)可用于比較不同濃度樣品的結(jié)果。SIS采樣器可以處理此應(yīng)用程序所需的小樣本量。另外,通過移除FX-Nano傳感器,該系統(tǒng)可用于標(biāo)準(zhǔn)的USP <787>和<788>注射用顆粒物。

 

 

 

 

 


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