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【知識庫】DSC vs DSF技術大比拼,誰更勝一籌

【知識庫】DSC vs DSF技術大比拼,誰更勝一籌
馬爾文帕納科  2025-02-19  |  閱讀:1713

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本文對比差式掃描量熱法(DSC)與差式掃描熒光法(DSF)兩種表征生物大分子高級結構穩(wěn)定性常用技術,幫助您了解兩種技術的異同點,在評估各類生物大分子的穩(wěn)定性時可以選擇合適的分析工具。

評估生物大分子的穩(wěn)定性至關重要,因為這直接關系到其在藥物開發(fā)、疾病診斷、治療以及基礎生物學研究中的應用前景和實際效能。穩(wěn)定性的評估能夠確保生物大分子在制備、存儲、運輸及應用過程中保持其結構和功能,從而發(fā)揮預期的生物學活性,提高生物產品的療效和安全性。此外,穩(wěn)定性數據對于優(yōu)化生物大分子的生產和純化過程、延長其貨架壽命、減少成本以及推動科學研究的深入都有著不可或缺的作用。

在生物技術藥物開發(fā)的“質量源于設計”(QbD) 方法中,穩(wěn)定性表征是所有候選藥物的“開發(fā)可行性”和“成藥性”評估以及流程開發(fā)和生產的一部分。穩(wěn)定性數據還整合到用于生產支持、生物技術藥物可比性和生物相似性評估的高級結構 (HOS) 表征和“指紋圖譜”中。

由于生物大分子結構十分復雜,生物物理工具在生物制藥產品的完全表征中非常重要。評估生物大分子穩(wěn)定性的生物物理工具多種多樣,其中差示掃描量熱法(DSC)與差示掃描熒光法(DSF)是表征生物大分子高級結構穩(wěn)定性的常用技術,本文主要聚焦兩種技術的異同點,旨在幫助大家選擇合適的技術評估各類生物大分子的穩(wěn)定性。


DSC 與 DSF,一字之差,大有不同

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01丨測試原理

DSC:溶液中生物大分子以恒定加熱速率由自然(折疊)到變性(展開),此過程涉及非共價鍵的斷裂為吸熱過程,DSC可以實時監(jiān)測生物分子隨溫度變化而發(fā)生的熱容(Cp)改變,通過對數據的處理(如積分)可以獲取如Tm值、Tonset、ΔH、ΔCp等熱力學信息。

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DSF:溶液中生物大分子以恒定加熱速率/不同變性劑條件下由自然(折疊)到變性(展開),DSF可以實時監(jiān)測由于色氨酸從疏水到親水環(huán)境所導致的發(fā)射波長改變/由于疏水區(qū)域暴露和環(huán)境敏感的疏水染料結合導致的熒光變化,進而獲取Tm、Tonset等參數。


02丨適用樣品類型

DSC:由于DSC是監(jiān)測維系生物分子高級結構非共價鍵斷裂的熱量吸收,所以對于蛋白、核酸、脂質等各類分子都適用。

DSF:由于DSF是監(jiān)測色氨酸或疏水區(qū)暴露所引起的發(fā)射波長或熒光信號的變化,所以測試樣品需有豐富的色氨酸/疏水區(qū),DSF僅適用某些蛋白樣品,不適用于核酸、脂質等樣品。若測試前蛋白已有部分變性(疏水區(qū)暴露)或樣品中含有去垢劑,則會造成較強的背景熒光。


03丨相關參數含義(Tm、ΔHcal

DSC:通過DSC測試所得到的Tm(熱轉變中點溫度)為體系中50%生物分子變性對應的溫度,即峰值所對應的溫度;ΔHcal為每摩爾蛋白變性所吸收的熱量,一般用于衡量體系中生物分子的活性含量。

DSF:通過DSF測試得到的Tm值為體系中50%色氨酸/疏水區(qū)暴露時所對應的溫度,色氨酸/疏水區(qū)的暴露無法真實的反應蛋白變性過程,同時無法獲得ΔH等樣品活性信息。


04丨應用

DSC:由于DSC具有良好的重復性,適合批間一致性分析和生物相似性打分分析;同時DSC具有結構域級分辨率(可區(qū)分抗體CH2、CH3、Fab區(qū)域),適用于抗體等多個結構域樣品的穩(wěn)定性評估。

DSF:DSF的重復性較差,難以進行定量分析,但分析速度較快,適合穩(wěn)定性的快速初步篩選。


05丨DSC 應用示例

DSC在核酸分析中的應用

與傳統(tǒng)的小分子藥物和抗體藥物相比,核酸藥物可針對不可成藥靶點、無需復雜蛋白生產工藝、具有設計簡便、研發(fā)周期短、靶向特異性強、治療領域廣泛和長效性等優(yōu)點,目前在遺傳疾病、腫瘤、病毒感染等疾病的治療上應用廣泛,有望成為繼小分子藥物和抗體藥物后的第三大類藥物。然而,由于核酸藥物本身攜帶負電、容易降解等問題,導致其穩(wěn)定性差、半衰期短、遞送效率低,因此需要經過化學修飾或者是遞送系統(tǒng)達到長期有效的治療效果。DSC可以非常靈敏的反應出核酸化學修飾前后穩(wěn)定性的差異,然而其他穩(wěn)定性分析技術可能無法反應出這些微小的變化。

DSC用于分析鎖核酸(LNA)摻入核酸的影響

鎖核酸(LNA)是一種經過修飾的RNA,LNA中一部分核糖上的2‘與4’碳連結在一起,降低了核糖結構的柔韌性,進而增強磷酸鹽骨架的局部結構的穩(wěn)定性。該應用利用DSC技術研究了LNA的摻入對DNA、RNA異源雙鏈體雜交熱力學的影響。LNA修飾后,峰圖明顯向右偏移;同時,隨著LNA修飾個數的增加,Tm值逐漸升高,表示雜交體的穩(wěn)定性因LNA的摻入變得更加穩(wěn)定。

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DSC用于表征mRNA-LNP

通過PEAQ-DSC提供的LNP熱力學指紋圖譜,可以對比游離mRNA、mRNA-LNP以及LNP的穩(wěn)定性變化(圖2)。從圖中來看,mRNA組裝于LNP之后,Tm增大,表明mRNA-lipid產生相互作用之后,能穩(wěn)定彼此結構,使得mRNA-LNP組裝更穩(wěn)定。


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與DSF技術相比,DSC技術具有多方面優(yōu)勢,因此被公認為是生物制藥行業(yè)中熱穩(wěn)定性試驗的金標準技術:

  • 無需標記,適用樣品類型更豐富,且不受熒光背景及buffer成分干擾;

  • 更寬的溫度范圍,適用具有較高Tm的樣品;

  • 提供除Tm之外豐富的熱力學信息;

  • 全局測定技術,具備高分辨率、高重復性,可分辨多結構域樣品;

如果您分析的樣品為不含色氨酸的蛋白樣品或其它非蛋白樣品,或是要進行精細的蛋白設計與改造、候選物篩選、配方優(yōu)化、可比性相似性評估等多種應用,DSC都將是您的最優(yōu)選擇!

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